Transporte de Ca2+ por vesiculas sinapticas: actividade, purificaçao e reconstituiçao do trocador Ca2+/H+ (PBIC/C/BIA/2081/95)

As vesículas sinápticas de terminais nervosos têm revelado capacidade de sequestração de Ca²⁺. Contudo, o mecanismo de transporte deste catião não foi ainda identificado.

Ensaios recentemente efectuados no nosso laboratório mostraram que vesículas sinápticas, isoladas do córtex cerebral de carneiro, apresentam actividade de antiporte Ca²⁺/H⁺ energizado pela força motriz da H⁺-ATPase, responsável pelo bombeamento de protões para o interior das vesículas. A existência de um trocador de Ca²⁺/H⁺ nas vesículas sinápticas capaz de, na presença de concentrações elevadas de Ca²⁺ extravesicular, translocar Ca²⁺ para o espaço intravesicular, induzindo simultaneamente a saída de H⁺, poderá contribuir para: (1) sequestração do excesso de Ca²⁺, (2) acidificação citosólica; (3) modificação do gradiente electroquímico de protões das vesículas com consequente alteração da exocitose selectiva dos diferentes neurotransmissores, em função dos respectivos transportadores vesiculares. Parece portanto de interesse estudar detalhadamente este sistema de translocação de Ca²⁺, uma vez que o ião Ca²⁺ é determinante na regulação dos processos de neurotransmissão.

Neste projecto serão investigadas as características bioquímicas do trocador Ca²⁺/H⁺ no que respeita à sua cinética, comportamento termotrópico, especificidade e inibição por ionóforos, fármacos e iões. A actividade do sistema será avaliada quer por análise de efluxo de protões (“quenching” de fluorescência da sonda alaranjado de acridina), quer por análise de captação de Ca²⁺ (radiometria utilizando ⁴⁵Ca) em vesículas sinápticas.

A actividade do sistema antiporte Ca²⁺/H⁺ depende do gradiente electroquímico de protões estabelecido pela H⁺-ATPase das vesículas sinápticas. Deste modo é possível acumulação activa de Ca²⁺ no interior das vesículas, funcionando como uma bomba de Ca²⁺ secundária. A sua dependência da bomba protónica será investigada no sentido de verificar se estes dois mecanismos estão relacionados directa ou indirectamente. Para isso, será estudada a actividade de antiporte Ca²⁺/H⁺ mediante a imposição artificial dum gradiente de pH (ácido no interior). A eficiência do trocador nestas condições indicará se ele opera independentemente da H⁺-ATPase. Será também estudada a influência do potencial de membrana nos parâmetros cinéticos do trocador, uma vez que o gradiente electroquímico de protões envolve duas componentes complementares, DpH e Dy, cuja magnitude depende da presença de iões permeantes (Cl^–) ou impermeantes (SO₄^2-), respectivamente. As alterações de potencial serão avaliadas fluorimetricamente ou espectrofotometricamente, utilizando a sonda, oxonol VI. Após a caracterização detalhada do antiporte Ca²⁺/H⁺, proceder-se-á à sua solubilização pelo detergente octilglucosídeo ou colato de sódio, seguida de reconstituição da sua actividade em lipossomas. Numa última fase tentaremos purificar a molécula do trocador relativamente à maioria das outras proteínas membranares e, conforme o grau de purificação obtido, determinaremos a sua estrutura primária.

Considerando o envolvimento do Ca²⁺ nos mecanismos de neurotransmissão, este estudo reveste-se de particular interesse na medida em que contribuirá para o conhecimento dos mecanismos responsáveis por: (1) regulação da homeostase do Ca²⁺ celular; (2) exocitose selectiva dos diferentes neurotransmissores; e (3) desencadeamento de neurotoxicidade mediada por receptores glutamatérgicos.

O presente projecto constitui a possibilidade de prosseguir os trabalhos já iniciados, de modo a abrir perspectivas de desenvolvimento duma linha de investigação em neurotoxicidade, com especial ênfase nos mecanismos celulares responsáveis pela elevada sensibilidade e selectividade das respostas celulares a diferentes agentes tóxicos.