A genotoxicidade constitui um dos principais efeitos dos contaminantes. Considerando os pesticidas dentro dos mais ubíquos e perigosos contaminantes, o “leitmotiv” do projecto foi a constatação de uma lacuna na literatura relativa à sua genotoxicidade em peixes. A bem documentada genotoxicidade em bactérias e mamíferos [1-3], assim como os resultados positivos obtidos nos escassos estudos em peixes [4-7], justificam um redireccionamento da investigação neste sentido. Não obstante estudos com mamíferos terem demonstrado que o dano no ADN e o stresse oxidativo podem estar relacionados no contexto da exposição a pesticidas [8-9], relativamente a peixes os mecanismos envolvidos permanecem por identificar.
Assim, as questões principais do projecto são a avaliação da genotoxicidade de pesticidas em peixes e o desenvolvimento de um conhecimento sólido sobre os respectivos mecanismos. A estratégia envolve a avaliação da genotoxicidade (i), acompanhada do estudo de processos cruciais para a extensão e tipo de dano, tais como (ii) activação/desintoxicação enzimática, (iii) mecanismos de defesa e (iv) reparação do ADN/renovação celular.
Como marcador de genotoxicidade (i) será adoptado o ensaio do cometa na sua versão padrão e em combinação com enzimas de reparação do ADN (FPG, endonuclease III), de forma a determinar quebras e bases oxidadas, respectivamente. Complementarmente, serão adoptados os testes de micronúcleos (MN) e de anomalias nucleares eritrociticas (ANE) como medidas de clastogenese/aneugenese. Como indicadores de activação e desintoxicação (ii) serão medidas actividades de citocromo P450-oxidases e conjugases. Os níveis de antioxidantes e proteínas de stresse expressarão os mecanismos de defesa (iii). A avaliação da natureza transitória das lesões no ADN (iv), resultado da reparação e renovação celular, será feita seguindo os indicadores de genotoxicidade no período pós-exposição.
Todos os parâmetros serão determinados em sangue, guelras, rim, fígado e cérebro, com excepção dos testes MN e ANE que serão aplicados apenas no sangue, de forma a comparar a vulnerabilidade de cada tecido. O organismo-teste será a enguia Europeia (Anguilla anguilla), dado possuir as principais características requeridas a uma espécie bioindicadora.
A utilização simultânea de múltiplos pesticidas é a regra e não a excepção nas práticas agrícolas. A situação real é ainda mais complexa já que os pesticidas surgem no ambiente aquático como parte dum cocktail de diferentes classes de contaminantes, pelo que a co-exposição a pesticidas e metais ou nutrientes é um cenário provável, nomeadamente em rios e lagos eutrofizados. Assim, de forma a avaliar a genotoxicidade de pesticidas sob condições ecologicamente realistas, o projecto será desenvolvido em 3 fases consecutivas e complementares: 1 – Exposições laboratoriais (horas-dias) a pesticidas representativos das principais classes, tais como endossulfão (organoclorado), glifosato (organofosforado) e carbofurão (carbamato), individualmente ou em misturas binárias; 2 – Exposições laboratoriais (horas-dias) a misturas pesticida-metal (Cr ou Cu) e pesticida-nutriente (nitrato ou nitrito); 3 – Exposições in situ (horas-dias) numa lagoa de água doce – Pateira de Fermentelos (centro de Portugal), adoptada como protótipo de sistema multi-contaminado (receptor de descargas domésticas, pesticidas e efluentes industriais contendo metais). Os peixes serão engaiolados sazonalmente e a análise de biomarcadores será complementada com análises de pesticidas e metais na água, sedimento e tecidos dos peixes.
A equipa de investigação integra membros com uma vasta experiência no estudo da toxicidade de diversos contaminantes em peixes [10,11], mas também jovens investigadores, dando cumprimento ao objectivo de proporcionar formação científica. O grupo tem demonstrado ter a percepção da importância das interacções entre compostos em condições de multi-contaminação (no campo [12] e no laboratório [13]), assim como o seu empenhamento na investigação da associação entre stresse oxidativo/biotransformação e danos no ADN [14,15]. Adicionalmente, o grupo possui um excelente conhecimento do modelo experimental (A. anguilla), acumulado ao longo de duas décadas de investigação [16]. Estes aspectos constituem um importante suporte para prossecução dos objectivos apontados.
A estratégia proposta é inovadora no contexto dos peixes, por um lado, pelo seu carácter integrador, consubstanciado na larga variedade de processos estudados e com papel modulador do dano no ADN, e por outro, pela aplicação do ensaio do cometa combinado com endonucleases, que pode oferecer valiosa informação sobre os mecanismos de indução de quebras. Finalmente, os resultados esperados fornecerão recomendações de grande utilidade para as entidades decisoras, fundamentais para a (re)formulação das regulamentações no sentido da protecção ambiental.